Thèse Année : 2022

Antibody diffusion in solid tumors : key role of affinity/avidity in "on target off tumor"

Diffusion des anticorps dans les tumeurs solides : rôle clé de l'affinité/avidité dans le "on target off tumor"

Résumé

BACKGROUND: Monoclonal antibodies (mAbs) are an important part of targeted therapies in many fields and particularly in cancerology by reaching their targets overexpressed on tumour cells (“on target - on tumour”). However, most of these targets are also expressed at basal level by healthy tissues generating some toxicities (“on target - off tumour”). An affinity antibody property for their targets is a key component of this targeting efficiency. Moreover, the diffusion of antibodies in the tumor is a poorly studied subject and closely related to the targeting efficiency of the mAb and the affinity.The aim of this project is to study the role of antibody affinity/avidity in tumour binding, diffusion and in the decrease of “on target - off tumour”.METHOD: We developed a range of human antibodies by phage display processing on human EGFR (hEGFR) target with different affinity levels. We studied these affinity levels by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and BIACORE assay by Surface Plasmon Resonance (SPR). We added this affinity feature by variable pH dependency properties. We confirmed this in vitro validation by cytometry assays (FACS) on different cell lines characterized by a gradient of EGFR level (from 103 to 106 receptors/cells) and particularly A 431 and MDAMB 231 cell lines respectively high and medium hEGFR level expression. Finally, in vivo studies were conducted with immunohistochemistry (IHC) analysis and Positron Emission Tomography Computed Tomography (PEC-CT) with antibodies Zirconium-89 radiolabelled to perform longitudinal non-invasive quantitative biodistribution study. In both in vivo studies, mice were xenografted with both tumor (A 431) and “healthy tissue” (MDAMB 231).RESULTS: We generated six human antibodies specific against human EGFR. Using different in vitro assays, we ranked these antibodies as low, medium and high affinity against EGFR compared with the high affinity Cetuximab and Panitumumab positive controls. We also observed pH dependency properties. Cytometry experiments on different cell lines expressing EGFR showed that only medium affinity level antibodies could bind overexpressed EGFR cell lines but not cell lines with medium and low expression of EGFR (that could mimic healthy tissues) at physiological pH. However, at acidic pH, these medium affinity antibodies could recover their binding abilities on cell line expressing medium level of EGFR without any binding on cell line expressing low level of this target. These medium affinity antibodies should be as effective as high affinity antibodies on tumors while being much less toxic on healthy tissues expressing low levels of the target.We confirmed these results in vivo with a preferential fixation on A 431 cell line (high hEGFR level expression) rather than on MDAMB 231 cell line (medium hEGFR level expression) for our antibodies while positive control antibodies Cetuximab and Panitumumab bind A 431 and MDAMB 231 cell lines similarly. Indeed, IHC antibody quantification showed that our antibodies bind MDAMB 231 cell line not significantly different than 13R4a negative control antibody but they better significantly bind A 431 cell line than 13R4a antibody. The same results were observed in PET-CT images quantification and conventional biodistribution quantification on the same cell lines.CONCLUSION and PERSPECTIVES: Our initial hypothesis was therefore verified with a selection of antibodies able to bind selectively cell line with high hEGFR level expression in order to reduce “on target - off tumour” toxicity due to binding on healthy tissue with hEGFR medium expression level. Additional research like binding competition or larger scale in vivo studies should increase the robustness of our results.
INTRODUCTION : Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont une part importante des thérapies ciblées dans de nombreux domaines et particulièrement en cancérologie en se liant à leurs cibles surexprimées sur les cellules tumorales (“on target - on tumor”). Cependant, la plupart de ces cibles sont aussi exprimées par les tissus sains à un niveau basal ce qui génère des toxicités (“on target - off tumor”). La propriété d’affinité d’un anticorps pour sa cible est un élément clé de l’efficacité de ce ciblage.Le but de ce projet est d’étudier le rôle de l’affinité/avidité dans le ciblage tumoral, la diffusion et la réduction du “on target - off tumor”.METHODE : Nous avons développé une gamme d’anticorps humains par le processus de phage display sur la cible EGFR humaine (hEGFR) avec des niveaux d’affinité différents. Nous avons étudié ces niveaux d’affinité par enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) et analyse BIACORE par Résonance Plasmonique de Surface (SPR). Nous avons ajouté à ces caractéristiques d’affinité des propriétés de pH dépendance variables. Nous avons confirmé ces résultats in vitro par des études en cytométrie (FACS) sur différentes lignées cellulaires caractérisées par un niveau d’EGFR graduel (de 103 à 106 récepteurs/cellules) et particulièrement les lignées cellulaires A 431 et MDAMB 231 respectivement avec un haut et moyen niveau d’expression d’hEGFR. Enfin, des études in vivo ont été menées avec une analyse en immunohistochimie (IHC) et tomographie par émission de positron couplée à la tomodensitométrie (PET-CT) avec des anticorps radioimmunoconjugués avec du Zirconium-89 pour effectuer une analyse de biodistribution quantitative non invasive longitudinale. Dans les deux études in vivo, les souris ont été greffées avec la tumeur (A 431) et l’équivalent au tissu sain (MDAMB 231).RESULTATS : Nous avons généré six anticorps humain dirigés contre l’EGFR humain. A l’aide de différentes méthodes in vitro, nous avons classé ces anticorps comme de faible, moyenne ou forte affinité pour EGFR en comparaison aux anticorps de contrôle positifs Cetuximab et Panitumumab de forte affinité. Nous avons également étudié les propriétés de pH dépendance. Les expériences de cytométrie sur les lignées exprimant des niveaux différents d’EGFR ont montré que seulement les anticorps d’affinité moyenne peuvent se fixer sur les lignées cellulaires sur exprimant hEGFR mais pas sur les lignées d’expression moyenne ou faible de la cible (qui peuvent mimer les tissus sains) au pH physiologique. Cependant, à pH acide, ces anticorps d’affinité moyenne peuvent retrouver leurs capacités de fixation sur les lignées cellulaires exprimant un niveau moyen d’hEGFR mais pas sur celles avec un niveau faible d’expression de la cible.Nous avons confirmé ces résultats in vivo avec une fixation préférentielle sur la lignée A 431 (haut niveau d’expression hEGFR) plutôt que sur la lignée MDAMB 231 (niveau d’expression hEGFR moyen) pour nos anticorps tandis que les anticorps de contrôle positif Cetuximab et Panitumumab se fixent sur les deux lignées de façon similaire. En effet, la quantification des anticorps par IHC nous montre que nos anticorps ne se fixent pas de façon significativement différente sur la lignée MDAMB 231 mais se fixe significativement mieux sur la lignée A 431 par rapport à l’anticorps de contrôle négatif 13R4a. Des résultats similaires ont été observés à l’aide de la quantification par imagerie PET-CT et de la biodistribution conventionnelle sur les mêmes lignées cellulaires.CONCLUSION et PERSPECTIVES : Notre hypothèse de départ a été vérifié avec une sélection d’anticorps capable de se fixer sur une lignée de forte expression d’EGFR humain dans le but de réduire la toxicité “on target - off tumor” liée à la fixation sur du tissu sain exprimant moyennement la même cible. Des recherches plus approfondies comme des compétitions de fixation ou des études in vivo à plus grande échelle devraient accroitre la robustesse de nos résultats.
Fichier principal
Vignette du fichier
GRACIA_2022_archivage.pdf (6.7 Mo) Télécharger le fichier
Origine Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04919328 , version 1 (29-01-2025)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04919328 , version 1

Citer

Matthieu Gracia. Diffusion des anticorps dans les tumeurs solides : rôle clé de l'affinité/avidité dans le "on target off tumor". Médecine humaine et pathologie. Université de Montpellier, 2022. Français. ⟨NNT : 2022UMONT092⟩. ⟨tel-04919328⟩
0 Consultations
0 Téléchargements

Partager

More